Լաբորատոր փորձեր

Առաջադրանք 1

Ամիլազային ակտիվության որոշումը:

Մանրէային ամիլազներ

Ամիլազները օսլան ու գլիկոգենը ճեղքող ֆերմենտներ են, որոնց կարելի է դասակարգել երկու` էնդո- և էկզոամիլազներ խմբի: Էնդոամիլազներից α-ամիլազը (1,4-α-D-գլյուկանգլյուկանահիդրոլազ կամ գլիկոգենազ) ճեղքում է օսլան` հիդրոլիզելով ամիլոզում և ամիլոպեկտինում առկա 1,4-α-կապերը: Օսլայի հիդրոլիզը ուղեկցվում է ցածրամոլեկուլային օլիգոշաքարների, α-դեքստրինների, մալտոզի և գլյուկոզի առաջացմամբ: Էկզոամիլազներից β-ամիլազը (1,4-α-D- գլյուկանմալտահիդրոլազ) օսլայի հիդրոլիզն իրականացնում է շըղթայի ծայրից` ճեղքելով յուրաքանչյուր երկրորդ 1,4-α-կապերը, որի արդյունքում առաջանում են մալտոզ և β-դեքստրիններ:

α-ամիլազը, ի տարբերություն β-ամիլազի, ջերմակայուն ֆերմենտ է և իր ակտիվությունը երկար ժամանակ պահպանում է 70°C ջերմաստիճանում, բայց զգայուն է թթվային pH-ի նկատմամբ և pH 3.3 արժեքում արագ կորցնում է ակտիվությունը:

Ամիլազների ակտիվ արտադրիչներ են բորբոսասնկերը (Aspergillus) և բակտերիաները 

(Bacillus):

Փորձի ընթացքի համար անհրաժեշտ նյութերը և պարագաները: Հետազոտվող մանրէային մաքուր կուլտուրա, օսլա, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4•7H2O, NaCl, CaCO3, ագար-ագար, թորած ջուր, չափանոթ, չափանշմամբ բաժակներ, լաբորատոր կշեռք, մագնիսական խառնիչ, Պետրիի թասեր, մանրէաբանական օղակ, սպիրտայրոց, բամբակյա անձեռոցիկ, ավտոկլավ, ջերմապահարան, մանրէազերծող լուծույթ:

Աշխատանքի ընթացքը: Պատրաստել ամիլազային ակտիվության որոշման համար համապատասխան սննդամիջավայր հետևյալ բաղադրությամբ (գ/լ). օսլա 10, (NH4)2SO4 2, K2HPO4 1, MgSO4•7H2O 1, NaCl 1, CaCO3 3, ագար-ագար 20, pH 7.4: Սննդամիջավայրը մանրէազերծել ավտոկլավացմամբ (1 ամճ պայմաններում 20 րոպե): Տաք սննդամիջավայրը լցնել մանրէազերծված Պետրիի թասերի մեջ, թողնել մինչև պնդանալը և չորացնել մակերեսը: Ուսումնասիրվող մանրէային կուլտուրաները բծերով ցանել սննդամիջավայրի մակերեսին: Աճեցնել մանրէների աճի համար օպտիմալ ջերմաստիճանային պայմաններում 1-7 օր:

Օսլայի հիդրոլիզը հայտնաբերելու համար աճած կուլտուրայով սննդամիջավայրի մակերեսը մշակել 3-5 մլ Լյուգոլի լուծույթով: Ամիլազային ակտիվության մասին վկայում է մանրէի աճի շուրջ թափանցիկ գոտիների առաջացումը, մինչդեռ Պետրիի թասի մակերեսը ամբողջությամբ ներկվում է կապույտ գույնի (նկար 115): Քանոնով չափել յուրաքանչյուր կուլտուրայի շուրջ առաջացած թափանցիկ գոտու մեծությունը: Ստացված արդյունքները, սննդամիջավայրի բաղադրությունը, պատրաստման եղանակը, մանրէազերծման պայմանակարգը և աճեցման պայմանները գրանցել գրանցամատյանում:

Առաջադրանք 2

Կազեինալիտիկ և ժելատինազային ակտիվության որոշումը:

Մանրէային պրոտեազներ

Պրոտեազները, ճեղքելով պեպտիդային կապերը, հիդրոլիզում են սպիտակուցները և պոլիպեպտիդները: Կախված հիդրոլիզվող սուբստրատի կառուցվածքից տարբերում են պրոտեինազներ, պոլիպեպտիդազներ և երկպեպտիդազներ: Պրոտեինազները հիդրոլիզում են չբնափոխված սպիտակուցները՝ առաջացնելով պեպտիդներ: Պոլիպեպտիդազները և երկպեպտիդազները հիդրոլիզում են, համապատասխանաբար, պոլիպեպտիդները և դիպեպտիդները՝ առաջացնելով ամինաթթուներ:

Պրոտեազներ սինթեզում են մի շարք մանրէներ` բացիլները, ակտինոմիցետները, միցելային սնկերը և այլն: Պրոտեազների ակտիվության ուսումնասիրման համար որպես սուբստրատ օգտագործում են ժելատինը կամ կազեինը:

Փորձի ընթացքի համար անհրաժեշտ նյութերը և պարագաները: Հետազոտվող մանրէային մաքուր կուլտուրա, մսապեպտոնային արգանակ, ժելատին, ճարպազրկված կաթի փոշի, ագար-ագար, թորած ջուր, չափանոթ, չափանշմամբ բաժակներ, լաբորատոր կշեռք, մագնիսական խառնիչ, Պետրիի թասեր, մանրէաբանական օղակ, սպիրտայրոց, բամբակյա անձեռոցիկ, ավտոկլավ, ջերմապահարան, մանրէազերծող լուծույթ:

Աշխատանքի ընթացքը: Կազեինալիտիկ ակտիվության դրսևորման համար պատրաստել համապատասխան սննդամիջավայր հետևյալ բաղադրությամբ (գ/լ). ճարպազրկված կաթի փոշի 100, ագար-ագար 20, pH 7.4: Կաթը և ագար-ագարը 

պատրաստել առանձին և մանրէազերծել ավտոկլավում 1 ամճ պայմաններում 20 րոպեի ընթացքում: Կաթի խտությունը խիտ լուծույթում չպետք է գերազանցի 15%-ը: Մանրէազերծված սննդամիջավայրերը մանրէազերծ պայմաններում խառնել, լցնել մանրէազերծված Պետրիի թասերի մեջ, թողնել մինչև պնդանալը և չորացնել մակերեսը: Ուսումնասիրվող մանրէային կուլտուրաները գծային ցանքի մեթոդով ցանել սննդամիջավայրի մակերեսին: Աճեցնել մանրէների աճի համար օպտիմալ ջերմաստիճանային պայմաններում 1-7 օր: Կազեինալիտիկ ակտիվության մասին կարելի է դատել մանրէի աճի շուրջ առաջացած թափանցիկ գոտիներով (նկար 116): Քանոնով չափել յուրաքանչյուր կուլտուրայի շուրջ առաջացած թափանցիկ գոտու մեծությունը: Ստացված արդյունքները, սննդամիջավայրի բաղադրությունը, պատրաստման եղանակը, մանրէազերծման պայմանակարգը և աճեցման պայմանները գրանցել գրանցամատյանում:

Ժելատինազային ակտիվության դրսևորման համար պատրաստել համապատասխան սննդամիջավայր հետևյալ բաղադրությամբ. մսապեպտոնային արգանակ 100 մլ, ժելատին 10-15 գ, pH 7.4: Սնընդամիջավայրը 5 մլ-ական լցնել սրվակների մեջ և մանրէազերծել ավտոկլավում 1 ամճ պայմաններում 20 րոպեի ընթացքում: Ուսումնասիրվող մանրէային կուլտուրաները ցանել մանրէաբանական ասեղով ներարկման մեթոդով: Աճեցնել մանրէների աճի համար օպտիմալ ջերմաստիճանային պայմաններում 1-7 օր: Ժելատինազային ակտիվության մասին վկայում է սննդամիջավայրի հեղուկացումը ստուգիչի համեմատ (նկար 117): Ստացված արդյունքները, սննդամիջավայրի բաղադրությունը, պատրաստման եղանակը, մանրէազերծման պայմանակարգը և աճեցման պայմանները գրանցել գրանցամատյանում:

Առաջադրանք 3

Enterococcus faecium մանրէի ֆիքսված պատրաստուկի պատրաստում պարզ ներկման մեթոդով և մանրադիտակում:

Դիտարկվող օբյեկտի համառոտ բնութագիրը

Դոմեն Bacteria

Ֆիլում Firmicutes

Դաս Bacilli

Կարգ Lactobacillales

Ընտանիք Enterococcaceae

Ցեղ Enterococcus

Տեսակ E. faecium

Արյուն պարունակող սննդամիջավայրերի մակերեսին առաջացնում են կլոր, սպիտակ կամ կաթնագույն, հարթ եզրերով և մակերեսով, մինչև 1 մմ տրամագծով գաղութներ (նկար 82 Ա): E. faecium-ը ձվաձև կամ գնդաձև 0.6-2.5 մկմ տրամագծով, էնդոսպոր չառաջացնող գրամդրական բակտերիաներ են (նկար 82 Բ): Երբեմն միավորվում են կարճ շղթաներում: Բջիջները ունակ են շարժման փոքրաթիվ մտրակներով: Պատիճ չեն առաջացնում: Աերոտոլերանտ անաերոբ են, քեմոօրգանահետերոտրոֆ, կաթնաթթվային խմորում հարուցող մանրէներ են: Խմորում են տարբեր ածխաջրեր՝ առաջացնելով հիմնականում L-կաթնաթթու և թթվեցնելով սննդամիջավայրը ընդհուպ pH-ի 4.2-4.6 արժեքները: Խմորումը չի ուղեկցվում գազառաջացմամբ: Կատալազ չեն սինթեզում: Աճի ջերմաստիճանային տիրույթը 10-45°C է, իսկ օպտիմումը՝ 37°C: Լավ աճում են սննդամիջավայրերում, որոնցում NaCl-ի պարունակությունը կազմում է 6.5%, լեղաթըթվային աղեր՝ 40%, pH-ը՝ 9.6: Ունակ են վերականգնելու նիտրատը: Լայն տարածված են շրջակա միջավայրում: E. faecium աղեստամոքսային ուղու մշտական ներկայացուցիչ է: Որոշ էնտերոկոկեր պայմանական ախտածին մանրէներ են:

Մանրէային կուլտուրա և փորձի ընթացքի համար անհրաժեշտ պարագաներ: E. faecium մանրէի մաքուր կուլտուրա, լուսային մանրադիտակ, քսուքի չորացման համար նախատեսված սարքավորում, մանրէաբանական օղակ, ունելի, սպիրտայրոց, ճարպազերծված առարկայական ապակիներ, մեթիլեն կապույտի լուծույթ, մայրիի յուղ, մանրէազերծված ծորակային ջուր, ֆիլտրի թուղթ, բենզին, էթանոլ, մանրէազերծող լուծույթ:

Աշխատանքի ընթացքը: Առարկայական ապակու մակերեսին կաթեցնել մանրէազերծված ծորակային ջրի կաթիլ, ապա կաթիլում կախույթ ստանալու նպատակով տեղադրել հետազոտվող մանրէային բջիջների ոչ մեծ քանակություն, տարածել քսուքի ստացման համար, չորացնել, ֆիքսել և ներկել մեթիլեն կապույտով: Այնուհետև լվանալ ծորակային ջրի բարակ շիթով, ֆիլտրի թղթով զգուշությամբ չորացնել պատրաստուկը ինչպես ցույց է տրված նկար 35-ում: Մանրադիտակը նախապատրաստել աշխատանքի և մանրադիտակել պատրաստուկը (նախապես պատրաստուկի վրա ավելացնելով 1 կաթիլ մայրիի յուղ) լուսային մանրադիտակմամբ իմերսիոն համակարգի 100 անգամ խոշորացնող օբյեկտիվի կիրառմամբ: Նկարել գրանցամատյանում: Պատրաստուկի մակերեսից ֆիլտրի թղթով հեռացնել յուղը և լվանալ առարկայական ապակին:

Առաջադրանք 4

Spirulina platensis մանրէի կենդանի պատրաստուկի պատրաստում ճզմված կաթիլի մեթոդով:

Դիտարկվող օբյեկտի համառոտ բնութագիրը

Դոմեն Bacteria

Ֆիլում Cyanobacteria

Դաս Chroobacteria

Կարգ Oscillatoriales

Ընտանիք Phormidiaceae

Ցեղ Spirulina

Տեսակ S. platensis

Պինդ սննդամիջավայրի մակերեսին առաջացնում են կլոր, հարթ եզրերով և մակերեսով գաղութներ (նկար 74 Բ): Թելանման օրգանիզմներ են, բաժանվում են միայն մեկ հարթությունում երկակի կիսմամբ: Թելիկի լայնությունը տատանվում է 1-5 մկմ սահմաններում, երկարությունը 12 մկմ է (նկար 74 Գ): Ֆոտոլիթոավտոտրոֆ են: Շնորհիվ նիտրոգենազ ֆերմենտի անաերոբ պայմաններում ունակ են դիազոտրոֆ սննդառության:

Հանդիպում են քաղցրահամ, ծովային և աղի ջրերում, որոշ տեսակներ հանդիպում են աղի լճերում և որոշ տաք աղբյուրներում, որոնց ջերմաստիճանը 50°C է: Կայուն են սուլֆիդի նկատմամբ:

Որոշ տեսակներ ունեն սննդային նշանակություն (օգտագործվում են որպես սպիտակուցի աղբյուր):

Մանրէային կուլտուրա և փորձի ընթացքի համար անհրաժեշտ պարագաներ: S. platensis մանրէի մաքուր կուլտուրա, լուսային մանրադիտակ, մանրէաբանական օղակ, ունելի, սպիրտայրոց, ճարպազերծված առարկայական ապակիներ և ծածկապակիներ, մանրէազերծված պիպետներ, մանրէազերծված ծորակային ջուր, ֆիլտրի թուղթ, մանրէազերծող լուծույթ:

Աշխատանքի ընթացքը: Առարկայական ապակու մակերեսին կաթեցնել մանրէազերծված ծորակային ջրի կաթիլ, ապա կաթիլում կախույթ ստանալու նպատակով տեղադրել հետազոտվող մանրէային բջիջների ոչ մեծ քանակություն, ծածկել ծածկապակիով ինչպես ցույց է տրված նկար 31-ում (տե՛ս գլուխ 5): Մանրադիտակը նախապատրաստել աշխատանքի և մանրադիտակել պատրաստուկը լուսային մանրադիտակմամբ չոր համակարգի 40 անգամ խոշորացնող օբյեկտիվով: Նկարել գրանցամատյանում, առարկայական ապակիները և ծածկապակիները լվանալ: