Լաբորատոր փորձեր

Առաջադրանք 1

Ամիլազային ակտիվության որոշումը:

Մանրէային ամիլազներ

Ամիլազները օսլան ու գլիկոգենը ճեղքող ֆերմենտներ են, որոնց կարելի է դասակարգել երկու` էնդո- և էկզոամիլազներ խմբի: Էնդոամիլազներից α-ամիլազը (1,4-α-D-գլյուկանգլյուկանահիդրոլազ կամ գլիկոգենազ) ճեղքում է օսլան` հիդրոլիզելով ամիլոզում և ամիլոպեկտինում առկա 1,4-α-կապերը: Օսլայի հիդրոլիզը ուղեկցվում է ցածրամոլեկուլային օլիգոշաքարների, α-դեքստրինների, մալտոզի և գլյուկոզի առաջացմամբ: Էկզոամիլազներից β-ամիլազը (1,4-α-D- գլյուկանմալտահիդրոլազ) օսլայի հիդրոլիզն իրականացնում է շըղթայի ծայրից` ճեղքելով յուրաքանչյուր երկրորդ 1,4-α-կապերը, որի արդյունքում առաջանում են մալտոզ և β-դեքստրիններ:

α-ամիլազը, ի տարբերություն β-ամիլազի, ջերմակայուն ֆերմենտ է և իր ակտիվությունը երկար ժամանակ պահպանում է 70°C ջերմաստիճանում, բայց զգայուն է թթվային pH-ի նկատմամբ և pH 3.3 արժեքում արագ կորցնում է ակտիվությունը:

Ամիլազների ակտիվ արտադրիչներ են բորբոսասնկերը (Aspergillus) և բակտերիաները 

(Bacillus):

Փորձի ընթացքի համար անհրաժեշտ նյութերը և պարագաները: Հետազոտվող մանրէային մաքուր կուլտուրա, օսլա, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4•7H2O, NaCl, CaCO3, ագար-ագար, թորած ջուր, չափանոթ, չափանշմամբ բաժակներ, լաբորատոր կշեռք, մագնիսական խառնիչ, Պետրիի թասեր, մանրէաբանական օղակ, սպիրտայրոց, բամբակյա անձեռոցիկ, ավտոկլավ, ջերմապահարան, մանրէազերծող լուծույթ:

Աշխատանքի ընթացքը: Պատրաստել ամիլազային ակտիվության որոշման համար համապատասխան սննդամիջավայր հետևյալ բաղադրությամբ (գ/լ). օսլա 10, (NH4)2SO4 2, K2HPO4 1, MgSO4•7H2O 1, NaCl 1, CaCO3 3, ագար-ագար 20, pH 7.4: Սննդամիջավայրը մանրէազերծել ավտոկլավացմամբ (1 ամճ պայմաններում 20 րոպե): Տաք սննդամիջավայրը լցնել մանրէազերծված Պետրիի թասերի մեջ, թողնել մինչև պնդանալը և չորացնել մակերեսը: Ուսումնասիրվող մանրէային կուլտուրաները բծերով ցանել սննդամիջավայրի մակերեսին: Աճեցնել մանրէների աճի համար օպտիմալ ջերմաստիճանային պայմաններում 1-7 օր:

Օսլայի հիդրոլիզը հայտնաբերելու համար աճած կուլտուրայով սննդամիջավայրի մակերեսը մշակել 3-5 մլ Լյուգոլի լուծույթով: Ամիլազային ակտիվության մասին վկայում է մանրէի աճի շուրջ թափանցիկ գոտիների առաջացումը, մինչդեռ Պետրիի թասի մակերեսը ամբողջությամբ ներկվում է կապույտ գույնի (նկար 115): Քանոնով չափել յուրաքանչյուր կուլտուրայի շուրջ առաջացած թափանցիկ գոտու մեծությունը: Ստացված արդյունքները, սննդամիջավայրի բաղադրությունը, պատրաստման եղանակը, մանրէազերծման պայմանակարգը և աճեցման պայմանները գրանցել գրանցամատյանում:

Առաջադրանք 2

Կազեինալիտիկ և ժելատինազային ակտիվության որոշումը:

Մանրէային պրոտեազներ

Պրոտեազները, ճեղքելով պեպտիդային կապերը, հիդրոլիզում են սպիտակուցները և պոլիպեպտիդները: Կախված հիդրոլիզվող սուբստրատի կառուցվածքից տարբերում են պրոտեինազներ, պոլիպեպտիդազներ և երկպեպտիդազներ: Պրոտեինազները հիդրոլիզում են չբնափոխված սպիտակուցները՝ առաջացնելով պեպտիդներ: Պոլիպեպտիդազները և երկպեպտիդազները հիդրոլիզում են, համապատասխանաբար, պոլիպեպտիդները և դիպեպտիդները՝ առաջացնելով ամինաթթուներ:

Պրոտեազներ սինթեզում են մի շարք մանրէներ` բացիլները, ակտինոմիցետները, միցելային սնկերը և այլն: Պրոտեազների ակտիվության ուսումնասիրման համար որպես սուբստրատ օգտագործում են ժելատինը կամ կազեինը:

Փորձի ընթացքի համար անհրաժեշտ նյութերը և պարագաները: Հետազոտվող մանրէային մաքուր կուլտուրա, մսապեպտոնային արգանակ, ժելատին, ճարպազրկված կաթի փոշի, ագար-ագար, թորած ջուր, չափանոթ, չափանշմամբ բաժակներ, լաբորատոր կշեռք, մագնիսական խառնիչ, Պետրիի թասեր, մանրէաբանական օղակ, սպիրտայրոց, բամբակյա անձեռոցիկ, ավտոկլավ, ջերմապահարան, մանրէազերծող լուծույթ:

Աշխատանքի ընթացքը: Կազեինալիտիկ ակտիվության դրսևորման համար պատրաստել համապատասխան սննդամիջավայր հետևյալ բաղադրությամբ (գ/լ). ճարպազրկված կաթի փոշի 100, ագար-ագար 20, pH 7.4: Կաթը և ագար-ագարը 

պատրաստել առանձին և մանրէազերծել ավտոկլավում 1 ամճ պայմաններում 20 րոպեի ընթացքում: Կաթի խտությունը խիտ լուծույթում չպետք է գերազանցի 15%-ը: Մանրէազերծված սննդամիջավայրերը մանրէազերծ պայմաններում խառնել, լցնել մանրէազերծված Պետրիի թասերի մեջ, թողնել մինչև պնդանալը և չորացնել մակերեսը: Ուսումնասիրվող մանրէային կուլտուրաները գծային ցանքի մեթոդով ցանել սննդամիջավայրի մակերեսին: Աճեցնել մանրէների աճի համար օպտիմալ ջերմաստիճանային պայմաններում 1-7 օր: Կազեինալիտիկ ակտիվության մասին կարելի է դատել մանրէի աճի շուրջ առաջացած թափանցիկ գոտիներով (նկար 116): Քանոնով չափել յուրաքանչյուր կուլտուրայի շուրջ առաջացած թափանցիկ գոտու մեծությունը: Ստացված արդյունքները, սննդամիջավայրի բաղադրությունը, պատրաստման եղանակը,