Thursday, July 16, 2020

Լաբորատոր փորձեր

Առաջադրանք 1
Ամիլազային ակտիվության որոշումը:
Մանրէային ամիլազներ

Ամիլազները օսլան ու գլիկոգենը ճեղքող ֆերմենտներ են, որոնց կարելի է դասակարգել երկու` էնդո- և էկզոամիլազներ խմբի: Էնդոամիլազներից α-ամիլազը (1,4-α-D-գլյուկանգլյուկանահիդրոլազ կամ գլիկոգենազ) ճեղքում է օսլան` հիդրոլիզելով ամիլոզում և ամիլոպեկտինում առկա 1,4-α-կապերը: Օսլայի հիդրոլիզը ուղեկցվում է ցածրամոլեկուլային օլիգոշաքարների, α-դեքստրինների, մալտոզի և գլյուկոզի առաջացմամբ: Էկզոամիլազներից β-ամիլազը (1,4-α-D- գլյուկանմալտահիդրոլազ) օսլայի հիդրոլիզն իրականացնում է շըղթայի ծայրից` ճեղքելով յուրաքանչյուր երկրորդ 1,4-α-կապերը, որի արդյունքում առաջանում են մալտոզ և β-դեքստրիններ:
α-ամիլազը, ի տարբերություն β-ամիլազի, ջերմակայուն ֆերմենտ է և իր ակտիվությունը երկար ժամանակ պահպանում է 70°C ջերմաստիճանում, բայց զգայուն է թթվային pH-ի նկատմամբ և pH 3.3 արժեքում արագ կորցնում է ակտիվությունը:
Ամիլազների ակտիվ արտադրիչներ են բորբոսասնկերը (Aspergillus) և բակտերիաները 
(Bacillus):



Փորձի ընթացքի համար անհրաժեշտ նյութերը և պարագաները: Հետազոտվող մանրէային մաքուր կուլտուրա, օսլա, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO47H2O, NaCl, CaCO3, ագար-ագար, թորած ջուր, չափանոթ, չափանշմամբ բաժակներ, լաբորատոր կշեռք, մագնիսական խառնիչ, Պետրիի թասեր, մանրէաբանական օղակ, սպիրտայրոց, բամբակյա անձեռոցիկ, ավտոկլավ, ջերմապահարան, մանրէազերծող լուծույթ:
Աշխատանքի ընթացքը: Պատրաստել ամիլազային ակտիվության որոշման համար համապատասխան սննդամիջավայր հետևյալ բաղադրությամբ (գ/լ). օսլա 10, (NH4)2SO2, K2HPO1, MgSO47H2O 1, NaCl 1, CaCO3, ագար-ագար 20, pH 7.4: Սննդամիջավայրը մանրէազերծել ավտոկլավացմամբ (1 ամճ պայմաններում 20 րոպե): Տաք սննդամիջավայրը լցնել մանրէազերծված Պետրիի թասերի մեջ, թողնել մինչև պնդանալը և չորացնել մակերեսը: Ուսումնասիրվող մանրէային կուլտուրաները բծերով ցանել սննդամիջավայրի մակերեսին: Աճեցնել մանրէների աճի համար օպտիմալ ջերմաստիճանային պայմաններում 1-7 օր:
Օսլայի հիդրոլիզը հայտնաբերելու համար աճած կուլտուրայով սննդամիջավայրի մակերեսը մշակել 3-5 մլ Լյուգոլի լուծույթով: Ամիլազային ակտիվության մասին վկայում է մանրէի աճի շուրջ թափանցիկ գոտիների առաջացումը, մինչդեռ Պետրիի թասի մակերեսը ամբողջությամբ ներկվում է կապույտ գույնի (նկար 115): Քանոնով չափել յուրաքանչյուր կուլտուրայի շուրջ առաջացած թափանցիկ գոտու մեծությունը: Ստացված արդյունքները, սննդամիջավայրի բաղադրությունը, պատրաստման եղանակը, մանրէազերծման պայմանակարգը և աճեցման պայմանները գրանցել գրանցամատյանում:



Առաջադրանք 2
Կազեինալիտիկ և ժելատինազային ակտիվության որոշումը:
Մանրէային պրոտեազներ
Պրոտեազներըճեղքելով պեպտիդային կապերըհիդրոլիզում են սպիտակուցները և պոլիպեպտիդներըԿախված հիդրոլիզվող սուբստրատի կառուցվածքից տարբերում են պրոտեինազներպոլիպեպտիդազներ և երկպեպտիդազներՊրոտեինազները հիդրոլիզում են չբնափոխված սպիտակուցները՝ առաջացնելով պեպտիդներՊոլիպեպտիդազները և երկպեպտիդազները հիդրոլիզում ենհամապատասխանաբարպոլիպեպտիդները և դիպեպտիդները՝ առաջացնելով ամինաթթուներ:
Պրոտեազներ սինթեզում են մի շարք մանրէներբացիլներըակտինոմիցետներըմիցելային սնկերը և այլնՊրոտեազների ակտիվության ուսումնասիրման համար որպես սուբստրատ օգտագործում են ժելատինը կամ կազեինը:
Փորձի ընթացքի համար անհրաժեշտ նյութերը և պարագաներըՀետազոտվող մանրէային մաքուր կուլտուրամսապեպտոնային արգանակժելատինճարպազրկված կաթի փոշիագար-ագարթորած ջուրչափանոթչափանշմամբ բաժակներլաբորատոր կշեռքմագնիսական խառնիչՊետրիի թասերմանրէաբանական օղակսպիրտայրոցբամբակյա անձեռոցիկավտոկլավջերմապահարանմանրէազերծող լուծույթ:
Աշխատանքի ընթացքըԿազեինալիտիկ ակտիվության դրսևորման համար պատրաստել համապատասխան սննդամիջավայր հետևյալ բաղադրությամբ (գ/լ). ճարպազրկված կաթի փոշի 100, ագար-ագար 20, pH 7.4: Կաթը և ագար-ագարը 

պատրաստել առանձին և մանրէազերծել ավտոկլավում 1 ամճ պայմաններում 20 րոպեի ընթացքումԿաթի խտությունը խիտ լուծույթում չպետք է գերազանցի 15%-ըՄանրէազերծված սննդամիջավայրերը մանրէազերծ պայմաններում խառնելլցնել մանրէազերծված Պետրիի թասերի մեջթողնել մինչև պնդանալը և չորացնել մակերեսըՈւսումնասիրվող մանրէային կուլտուրաները գծային ցանքի մեթոդով ցանել սննդամիջավայրի մակերեսինԱճեցնել մանրէների աճի համար օպտիմալ ջերմաստիճանային պայմաններում 1-7 օրԿազեինալիտիկ ակտիվության մասին կարելի է դատել մանրէի աճի շուրջ առաջացած թափանցիկ գոտիներով (նկար 116): Քանոնով չափել յուրաքանչյուր կուլտուրայի շուրջ առաջացած թափանցիկ գոտու մեծությունըՍտացված արդյունքներըսննդամիջավայրի բաղադրությունըպատրաստման եղանակըմանրէազերծման պայմանակարգը և աճեցման պայմանները գրանցել գրանցամատյանում:
Ժելատինազային ակտիվության դրսևորման համար պատրաստել համապատասխան սննդամիջավայր հետևյալ բաղադրությամբմսապեպտոնային արգանակ 100 մլժելատին 10-15 գ, pH 7.4: Սնընդամիջավայրը 5 մլ-ական լցնել սրվակների մեջ և մանրէազերծել ավտոկլավում 1 ամճ պայմաններում 20 րոպեի ընթացքումՈւսումնասիրվող մանրէային կուլտուրաները ցանել մանրէաբանական ասեղով ներարկման մեթոդովԱճեցնել մանրէների աճի համար օպտիմալ ջերմաստիճանային պայմաններում 1-7 օրԺելատինազային ակտիվության մասին վկայում է սննդամիջավայրի հեղուկացումը ստուգիչի համեմատ (նկար 117): Ստացված արդյունքներըսննդամիջավայրի բաղադրությունըպատրաստման եղանակըմանրէազերծման պայմանակարգը և աճեցման պայմանները գրանցել գրանցամատյանում:



Առաջադրանք 3

Enterococcus faecium մանրէի ֆիքսված պատրաստուկի պատրաստում պարզ ներկման մեթոդով և մանրադիտակում:
Դիտարկվող օբյեկտի համառոտ բնութագիրը
Դոմեն Bacteria
Ֆիլում Firmicutes
Դաս Bacilli
Կարգ Lactobacillales
Ընտանիք Enterococcaceae
Ցեղ Enterococcus
Տեսակ E. faecium
Արյուն պարունակող սննդամիջավայրերի մակերեսին առաջացնում են կլորսպիտակ կամ կաթնագույնհարթ եզրերով և մակերեսովմինչև 1 մմ տրամագծով գաղութներ (նկար 82 Ա): E. faecium-ը ձվաձև կամ գնդաձև 0.6-2.5 մկմ տրամագծովէնդոսպոր չառաջացնող գրամդրական բակտերիաներ են (նկար 82 Բ): Երբեմն միավորվում են կարճ շղթաներումԲջիջները ունակ են շարժման փոքրաթիվ մտրակներովՊատիճ չեն առաջացնումԱերոտոլերանտ անաերոբ ենքեմոօրգանահետերոտրոֆկաթնաթթվային խմորում հարուցող մանրէներ ենԽմորում են տարբեր ածխաջրեր՝ առաջացնելով հիմնականում L-կաթնաթթու և թթվեցնելով սննդամիջավայրը ընդհուպ pH-ի 4.2-4.6 արժեքներըԽմորումը չի ուղեկցվում գազառաջացմամբԿատալազ չեն սինթեզումԱճի ջերմաստիճանային տիրույթը 10-45°էիսկ օպտիմումը՝ 37°C: Լավ աճում են սննդամիջավայրերումորոնցում NaCl-ի պարունակությունը կազմում է 6.5%, լեղաթըթվային աղեր՝ 40%, pH-ը՝ 9.6: Ունակ են վերականգնելու նիտրատըԼայն տարածված են շրջակա միջավայրումE. faecium աղեստամոքսային ուղու մշտական ներկայացուցիչ էՈրոշ էնտերոկոկեր պայմանական ախտածին մանրէներ են:
Մանրէային կուլտուրա և փորձի ընթացքի համար անհրաժեշտ պարագաներ: E. faecium մանրէի մաքուր կուլտուրա, լուսային մանրադիտակ, քսուքի չորացման համար նախատեսված սարքավորում, մանրէաբանական օղակ, ունելի, սպիրտայրոց, ճարպազերծված առարկայական ապակիներ, մեթիլեն կապույտի լուծույթ, մայրիի յուղ, մանրէազերծված ծորակային ջուր, ֆիլտրի թուղթ, բենզին, էթանոլ, մանրէազերծող լուծույթ:
Աշխատանքի ընթացքը: Առարկայական ապակու մակերեսին կաթեցնել մանրէազերծված ծորակային ջրի կաթիլ, ապա կաթիլում կախույթ ստանալու նպատակով տեղադրել հետազոտվող մանրէային բջիջների ոչ մեծ քանակություն, տարածել քսուքի ստացման համար, չորացնել, ֆիքսել և ներկել մեթիլեն կապույտով: Այնուհետև լվանալ ծորակային ջրի բարակ շիթով, ֆիլտրի թղթով զգուշությամբ չորացնել պատրաստուկը ինչպես ցույց է տրված նկար 35-ում: Մանրադիտակը նախապատրաստել աշխատանքի և մանրադիտակել պատրաստուկը (նախապես պատրաստուկի վրա ավելացնելով 1 կաթիլ մայրիի յուղ) լուսային մանրադիտակմամբ իմերսիոն համակարգի 100 անգամ խոշորացնող օբյեկտիվի կիրառմամբ: Նկարել գրանցամատյանում: Պատրաստուկի մակերեսից ֆիլտրի թղթով հեռացնել յուղը և լվանալ առարկայական ապակին:




Առաջադրանք 4
Spirulina platensis մանրէի կենդանի պատրաստուկի պատրաստում ճզմված կաթիլի մեթոդով:
Դիտարկվող օբյեկտի համառոտ բնութագիրը
Դոմեն Bacteria
Ֆիլում Cyanobacteria
Դաս Chroobacteria
Կարգ Oscillatoriales
Ընտանիք Phormidiaceae
Ցեղ Spirulina
Տեսակ S. platensis
Պինդ սննդամիջավայրի մակերեսին առաջացնում են կլորհարթ եզրերով և մակերեսով գաղութներ (նկար 74 Բ): Թելանման օրգանիզմներ ենբաժանվում են միայն մեկ հարթությունում երկակի կիսմամբԹելիկի լայնությունը տատանվում է 1-5 մկմ սահմաններումերկարությունը 12 մկմ է (նկար 74 Գ): Ֆոտոլիթոավտոտրոֆ ենՇնորհիվ նիտրոգենազ ֆերմենտի անաերոբ պայմաններում ունակ են դիազոտրոֆ սննդառության:


Հանդիպում են քաղցրահամ, ծովային և աղի ջրերում, որոշ տեսակներ հանդիպում են աղի լճերում և որոշ տաք աղբյուրներում, որոնց ջերմաստիճանը 50°C է: Կայուն են սուլֆիդի նկատմամբ:

Որոշ տեսակներ ունեն սննդային նշանակություն (օգտագործվում են որպես սպիտակուցի աղբյուր):
Մանրէային կուլտուրա և փորձի ընթացքի համար անհրաժեշտ պարագաներ: S. platensis մանրէի մաքուր կուլտուրա, լուսային մանրադիտակ, մանրէաբանական օղակ, ունելի, սպիրտայրոց, ճարպազերծված առարկայական ապակիներ և ծածկապակիներ, մանրէազերծված պիպետներ, մանրէազերծված ծորակային ջուր, ֆիլտրի թուղթ, մանրէազերծող լուծույթ:
Աշխատանքի ընթացքը: Առարկայական ապակու մակերեսին կաթեցնել մանրէազերծված ծորակային ջրի կաթիլ, ապա կաթիլում կախույթ ստանալու նպատակով տեղադրել հետազոտվող մանրէային բջիջների ոչ մեծ քանակություն, ծածկել ծածկապակիով ինչպես ցույց է տրված նկար 31-ում (տե՛ս գլուխ 5): Մանրադիտակը նախապատրաստել աշխատանքի և մանրադիտակել պատրաստուկը լուսային մանրադիտակմամբ չոր համակարգի 40 անգամ խոշորացնող օբյեկտիվով: Նկարել գրանցամատյանում, առարկայական ապակիները և ծածկապակիները լվանալ:

No comments:

Post a Comment